Обзор применения технологий секвенирования следующего поколения в исследованиях микробиомов пищевых продуктов
Хорошо известно, что болезни, передающиеся через пищевые продукты, вызывают значительное количество заболеваний и смертельных случаев, особенно у лиц с ослабленным иммунитетом и у детей младшего возраста. Многие болезни пищевого происхождения вызываются бактериями, вирусами и паразитами. Следовательно, во многих странах регулярно поступают сообщения о спорадических инфекциях или вспышках. Кроме того, усиливающаяся глобализация привела к передаче пищевых патогенов через международные границы, что серьезно сказалось на торговле и продовольственной безопасности. Это привело к тому, что национальные правительства и международные органы создали тщательно продуманные механизмы контроля в целях повышения безопасности пищевых продуктов. Таким образом, на различные системы производства продовольствия ложится бремя обеспечения безопасности продуктов питания для потребления.
Пища, являющаяся неотъемлемой частью повседневной жизни, проходит множество этапов переработки, прежде чем попадает к потребителю. Общая численность всех микроорганизмов (микробиом) играет важную роль в любой пищевой матрице, начиная от ферментации, загрязнения и порчи. Глубокое таксономическое понимание микроорганизмов и их сообществ необходимо либо для улучшения желаемых пищевых процессов, таких как ферментация, либо для смягчения таких пагубных явлений, как загрязнение и порча. Исторически сложилось так, что для выделения, идентификации и характеристики бактерий клинического, пищевого или экологического происхождения используются традиционные методы, в том числе классическая окраска по Граму наряду с индивидуальными биохимическими характеристиками. Несмотря на то, что они считаются "золотым стандартом", методы, зависящие от культуры, могут обнаружить только 0,1% сложного сообщества, например, такого, которое обнаруживается в микробиоте кишечника человека. Поэтому для расширения понимания экологической ниши, такой как пища, необходимы методы идентификации или характеристики микроорганизмов и прогнозирования функциональных взаимодействий различных микробиологических сообществ, присутствующих в образце. С этой целью современные достижения в области многоатомных технологий позволили профилировать микробные сообщества, осуществлять мониторинг популяционных колебаний в различных микробных экосистемах и определять характеристики различных видов микроорганизмов в пищевых матрицах.
Быстрое развитие технологий и лабораторного оборудования для секвенирования нуклеиновых кислот за последние четыре десятилетия расширило возможности определения характеристик микроорганизмов в сложных матрицах пищевых или экологических образцов. Вездесущая природа и специфика нуклеиновых кислот делают молекулу идеальной мишенью для характеризации бактерий или микроорганизмов. Используя значительные достижения в области секвенирования химических веществ, секвенирование ДНК постепенно эволюционировало от секвенирования фрагментов с низкой пропускной способностью к секвенированию с высокой пропускной способностью следующего поколения (NGS) и методам секвенирования третьего поколения.
Традиционно большинство исследований пищевых микробиомов, связанных с секвенированием нового поколения, сосредоточено на ферментированных продуктах, таких как сыры, кимчи и колбасы. Различные исследования позволили не только охарактеризовать микробный состав ферментированных продуктов питания, но и выявить изменения в структуре микробов с течением времени, а также изменения в структуре экспрессии генов, связанные с различными стадиями ферментации. По сравнению с ферментированными продуктами исследования по выявлению и характеристике микробиома неферментированных продуктов являются скудными.
Преимущества NGS перед секвенированием по Сэнгеру можно представить следующим образом:
конструирование библиотеки секвенирования in vitro;
клональная амплификация фрагментов ДНК in vitro;
секвенирование на основе чипов, позволяющее мультиплексировать фрагменты ДНК;
иммобилизация ДНК в твердой фазе.
Разработка методов секвенирования следующего поколения (NGS) позволила исследователям изучать и понимать мир микроорганизмов с более широкой и глубокой перспективы. Современные достижения в области технологий секвенирования ДНК не только позволили более точно охарактеризовать геномы бактерий, но и обеспечили более глубокую таксономическую идентификацию сложных микроорганизмов, которые по своей геномной сущности являются совокупным генетическим материалом микроорганизмов, обитающих в окружающей среде, независимо от того, является ли окружающая среда эконикой конкретного тела (например, содержимое кишечника человека) или эконикой предприятия пищевой промышленности (например, дренажные трубы). На сегодняшний день секвенирование рДНК 16S, метагеномика и метатранскриптомика являются тремя основными стратегиями секвенирования, используемыми для таксономической идентификации и описания микроорганизмов, связанных с пищевыми продуктами. В этих стратегиях секвенирования используются различные NGS-платформы для идентификации последовательностей ДНК и РНК. Традиционно секвенирование РНК 16S играло ключевую роль в понимании таксономического состава пищевого микробиома. В последнее время метагеномные подходы привели к более глубокому пониманию микробиома, обеспечив характеризацию на видовом уровне/уровне деформации. Кроме того, метатранспарентные подходы способствовали функциональной характеристике сложных взаимодействий между различными сообществами микроорганизмов в рамках одного микробиома. Во многих исследованиях особое внимание уделяется использованию методов секвенирования следующего поколения при исследовании микробиома ферментированных пищевых продуктов. Однако использование NGS при изучении микробиома неферментированных пищевых продуктов носит ограниченный характер.
